Gesundheit

Verknüpfung von Phänotypen zu Genotypen: Eine neu konzipierte gen-editing-Strategie

Die macht und die Bequemlichkeit von modernen Textverarbeitungsprogrammen, wie Microsoft Word, haben revolutioniert unseren täglichen Aufgaben. Brauchen zu erstellen eine schnelle Lebenslauf für eine neue Stelle? Zaudern auf, dass der Letzte term Papier wegen morgen? Auch schnelles erstellen einer Einkaufsliste – die Meisten von uns verlassen sich auf word-processing Programme als Verwalter von unserem Leben geschrieben. Die Funktionalität ist beeindruckend und im Gegensatz zu seinen archaischen Vorgänger, der Typ Schriftsteller, nur ein paar Tastendrücken können Sie ändern, löschen oder hinzufügen von Worten, wie der Benutzer es wünscht.

Für Jahre haben Forscher suchen nach Möglichkeiten, zu imitieren, um diese Fähigkeiten, sondern auf die genetische Skala, um genau und effizient zu verändern, die genetische information. Die Entwicklung einer „Microsoft-Word-DNA,“ würde es ermöglichen Wissenschaftlern die Möglichkeit, bessere Untersuchung der Funktion einzelner Gene und Mutationen, die dazu beitragen, genetische Störungen. Mit einer einzigen Entdeckung, genannt CRISPR-Cas9, wurden Wissenschaftler für immer ein Upgrade von DNA-Schreibmaschinen für eine DNA-word-Prozessor; Bearbeiten von Genen, die mit der gleichen Leichtigkeit, Präzision und Vielseitigkeit. Die Technologie hat gewaltige Zugkraft und Beliebtheit durch Ihre Flexibilität und individuell anpassbare Natur.

Obwohl Sie mächtig sind CRISPR ist weit von einer perfekten Technik und wie alle anderen, hat seine Nachteile und Einschränkungen. Eines seiner primären verwendet, beinhaltet die präzise Ausrichtung und mutiert ein gen von Interesse, so dass es nicht mehr funktioniert innerhalb einer bestimmten Art von Zelle. Wenn ein gen ist nicht gerendert, charakteristische Veränderungen in der Zelle (bekannt als Phänotypen) können untersucht werden, um sich ein besseres Bild von dem, was das Besondere gen hat. Aber die Art und Weise CRISPR mutiert einzelner Gene kann eine Herausforderung für die Forscher. Wenn in einer Zelle platziert, die CRISPR-Cas9-system genau mutiert, die eine gezielte gen, indem die Zell-DNA. Die Zelle dann repariert seine defekte DNA überwiegend durch einen Prozess namens nonhomologous end-joining (NHEJ). Aber diese Reparatur-Prozess ist fehleranfällig und kann die Ursache für die Variabilität in den reparierten DNA; oft führen zu Substitutionen, Löschungen oder Ergänzungen der genetische code. Hinzufügen die Herausforderung ist, dass die Effizienz der CRISPR kann variieren, handeln zu Rendern beide Kopien eines gezielten gen nicht funktionsfähig oder manchmal auch nur eines. Diese unbekannten CRISPR verursachten DNA-Veränderungen machen es extrem schwierig für Wissenschaftler, um zu interpretieren, die zugrunde liegenden genetischen Ursache einer beobachteten Phänotyp; macht das tool weit weniger nützlich.

In einer aktuellen Publikation in Cell Reports, die Taniguchi-Labor am Max Planck Florida Institute for Neuroscience (MPFI) haben eine neue Methode entwickelt, die es ermöglicht die Verknüpfung von Phänotyp zu Genotyp. Innovativ und kombiniert die innovative Technik der laser-Mikrodissektion mit single-cell-Genotypisierung, die Taniguchi-Lab hat eine experimentelle pipeline in der Lage zu studieren CRISPR-vermittelte Wirkungen in den Zellen, während genau festzustellen, um die genaue DNA-Veränderungen, die Sie verursacht. Dieses Roman-Protokolls eröffnet neue Möglichkeiten in der Studie für Neurobiologie und weiterer ausbau der bereits starken Fähigkeiten CRISPR.

„Obwohl CRISPR präzise Ziele eines Gens von Interesse, da NHEJ, können die Wirkungen sehr variabel sein“, erklärt Andre Steinecke, Ph. D., Research Fellow und Erstautor der Veröffentlichung. „CRISPR verlassen können Zellen entweder vollständig nicht-funktionaler Gene, geschwächt Gene oder manchmal sogar verbessern Ihre Funktion. Das ist nicht so ein problem, wenn das entfernen einer, dass Ursachen, die eine sehr spürbare Wirkung in den Zellen, denn Sie können einfach visualisieren die Veränderung und die Abwesenheit des proteins, kodiert durch die gene. Aber einige, vor allem Gene im Gehirn, nicht auffallend offensichtliche Effekte oder sind sehr schwer sichtbar zu machen. Unser Ziel war die Schaffung einer breit anwendbaren Strategie, der fähig ist, zuverlässig zu bestimmen, die genaue genetische Ursache und korrelieren es zum beobachteten Phänotyp.“

Zur Validierung Ihrer Strategie, das team auf MPFI entwickelt CRISPR-Technologie, um den Gegner ein gen in pyramidalen Neuronen die Kodierung einer kritischen strukturellen protein namens Ankyrin-G (AnkG). Normalerweise werden die AnkG-protein ist beschränkt auf eine spezielle region des Neurons, bekannt als axon initial segment (AIS), die verantwortlich ist für die Generierung von aktionspotentialen. Wenn AnkG entfernt, die AIS erfährt eine deutliche Verdickung, kann erkannt werden, mit Hilfe der Mikroskopie. Mit dieser charakteristischen Funktion, Neuronen, Mangel AnkG werden könnte, leicht zu unterscheiden und Ihre genaue Genotyp konnte dann bestätigt werden. Sie fanden heraus, dass überwiegend, Neuronen transfiziert mit Ihren CRISPR-Sonde zeigte einen Verlust von AnkG sowie erheblich verdickt AIS. Aber ein kleiner Teil der Neuronen transfiziert mit CRISPR noch zeigte AnkG Ebenen und AIS-Dicke vergleichbar mit den Wildtyp Neuronen; demonstrieren Sie die unterschiedlichen Auswirkungen des CRISPR auf verschiedene Zellen. Zu prüfen, und bestätigen Sie die zugrunde liegenden genetischen Ursachen, die das team dann verwendet der laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren einzelner Neuronen, deren Phänotyp wurde bereits charakterisiert. Sobald extrahiert, das team sequenziert jede einzelne Zelle separat zu bestimmen, der Genotyp. Sie fand, dass Ihre Strategie konnte zuverlässig und reproduzierbar link beobachteten Phänotyp zu Genotyp, an denen die Neuronen fehlt AnkG mit verdickten Axone zeigte loss-of-function-Mutationen in beiden Kopien des Gens in der Erwägung, dass Neuronen mit normaler AnkG entweder zeigten Mutationen in nur eine Kopie (Neuronen transfiziert mit CRISPR) oder normal-Genotypen (Kontrolle Neuronen). Das team, dann bestätigt Ihre Strategie mit zwei weiteren Genen, MeCP2 und Satb2, zu finden, dass Ihr Prozess könnte noch einmal effektiv korrelieren beobachtet feature auf die zugrunde liegende Genetik.

„CRISPR/Cas9-basierten gen-targeting birgt ein großes Versprechen für systematische Verständnis der molekularen basis zugrunde, die Montage, Funktion und Dysfunktion neuronaler schaltkreise“, stellt Hiroki Taniguchi, Ph. D. „Die perfekte Abstimmung zwischen den Genotypen bestimmt durch unsere single-cell sequencing und diejenigen, die sich durch Phänotyp-Bewertung, deutet darauf hin, dass unser Ansatz ist es, eine leistungsfähige, neue Methode kann die Verbesserung der Zuverlässigkeit und die Erweiterung der Anwendungen von CRISPR-basierte Techniken.“